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實(shí)驗(yàn)新人必讀(五):細(xì)胞培養(yǎng)那些事兒

更新時(shí)間:2017-03-06      點(diǎn)擊次數(shù):4409

 導(dǎo)語(yǔ)

 

細(xì)胞培養(yǎng)的路上,有多虐心就有多少需要值得注意的地方。小小的平皿之中,細(xì)胞點(diǎn)點(diǎn),引無(wú)數(shù)英雄競(jìng)掛東南枝。正所謂“萬(wàn)事開(kāi)頭難”,即便是細(xì)胞復(fù)蘇與保存這兩件看似簡(jiǎn)單的事情,也能造成實(shí)驗(yàn)汪內(nèi)心無(wú)比巨大的陰影面積。好在小魚(yú)這里有本細(xì)胞培養(yǎng)秘籍,可讓細(xì)胞這個(gè)熊孩子*變?yōu)槟愕馁N心小棉襖。

 

其實(shí),剛剛復(fù)蘇的細(xì)胞就像是剛剛出生的baby,非常脆弱,需要各位小伙伴的細(xì)心呵護(hù),不然,細(xì)胞就會(huì)被我們花樣玩死。為了避免細(xì)胞不明不白的掛掉,我們就要對(duì)細(xì)胞的各種習(xí)性了如指掌。

 

1. 俗語(yǔ)道,到什么山上唱什么歌,不同細(xì)胞用不同的培養(yǎng)液。此時(shí),就不得不提起培養(yǎng)基里的“四大金剛”—MEM、DMEM、1640、F-12,它們基本參與了90%以上種類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程。

 

MEM作為帶頭大哥,能力非常全面,號(hào)稱(chēng)是應(yīng)用zui廣泛的細(xì)胞培養(yǎng)液。

 

DMEM作為隨時(shí)緊跟老大MEM的二弟,青出于藍(lán)而勝于藍(lán),濃度要高出2~4倍,可分為高糖型(含葡萄糖4500mg/L)和低糖型(含葡萄糖1000mg/L)。

 

老三1640中規(guī)中矩,營(yíng)養(yǎng)成分比較簡(jiǎn)單,比DMEM少一點(diǎn)糖和谷光甘肽,常用于淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)。

 

小兄弟F12常用來(lái)支持CHO、Hela和L-細(xì)胞生長(zhǎng)以及原代大鼠肝細(xì)胞和前列腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)。MEM和F12 這兩種培養(yǎng)基各取1/2,即可形成神經(jīng)生物學(xué)zui通用的培養(yǎng)基。

 

在此,奉送一個(gè)不同細(xì)胞系對(duì)應(yīng)的不同培養(yǎng)液的圖,供大家參考。

 



2. 細(xì)胞生長(zhǎng)的空間密度是細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵。具體養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)該摸索細(xì)胞喜歡的生長(zhǎng)空間密度,既不能讓細(xì)胞瓶里的細(xì)胞因擁擠不堪而萎靡不振;也不能讓細(xì)胞濃度低于1~5×10^5個(gè)/mL而導(dǎo)致“孤獨(dú)死”(因?yàn)榧?xì)胞的健康生長(zhǎng)需要細(xì)胞間的連接)。因而細(xì)胞接種前,要先通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)調(diào)整細(xì)胞濃度。

 

3. 當(dāng)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞形態(tài)不好時(shí),可在傳代時(shí),先倒掉舊的培養(yǎng)基,加入3ml新的培養(yǎng)基(有無(wú)血清都可以)洗滌一次,用滴管吸走,再加入3ml培養(yǎng)基,沿著瓶底輕輕吹打一遍,然后吸走。這時(shí)在正式進(jìn)行消化、吹打。

 

其次,把吹打下的細(xì)胞懸液加入到含有新培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),置于培養(yǎng)箱里培養(yǎng),按時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞貼壁情況(10min,20min,30min)。而后迅速倒出其中的培養(yǎng)基,加入3ml新培養(yǎng)基再輕輕洗一次,然后加入*培養(yǎng)基培養(yǎng)并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況以及形態(tài)。直至找到細(xì)胞的形態(tài)為止。

 

4. 至于在培養(yǎng)瓶中加入多少培養(yǎng)基量,則是需要實(shí)驗(yàn)汪們自己去摸索的。對(duì)于生長(zhǎng)快的細(xì)胞,易生長(zhǎng)的細(xì)胞加少一點(diǎn)培養(yǎng)基,細(xì)胞形態(tài)會(huì)更好,但是要注意對(duì)換液時(shí)間的把握。

 

5. 如何選擇培養(yǎng)瓶。一般,生長(zhǎng)速度慢的細(xì)胞如果想要更漂亮的細(xì)胞狀態(tài),那么采用塑料瓶會(huì)比玻璃瓶的效果好;生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞,用玻璃瓶培養(yǎng)的效果會(huì)更好。因此,對(duì)于同一種細(xì)胞,在其生長(zhǎng)速度慢的時(shí)候(比如細(xì)胞剛復(fù)蘇時(shí)或者原代培養(yǎng)),塑料瓶會(huì)好一點(diǎn);而在其生長(zhǎng)旺盛的時(shí)候,玻璃瓶則相對(duì)會(huì)好一點(diǎn)。

 

6. 細(xì)胞凍存時(shí),蓋子要擰緊,不然復(fù)蘇水浴時(shí)會(huì)滲水,造成細(xì)胞污染。因而凍存管要選擇原配的管子和蓋子(不同牌子、型號(hào)的管子會(huì)有差別),蓋子擰緊后用封口膜封住。且每支凍存管都要標(biāo)上細(xì)胞的名稱(chēng)、凍存時(shí)間,并記錄在冊(cè),以免后續(xù)復(fù)蘇細(xì)胞時(shí),取錯(cuò)細(xì)胞。

 

7. 細(xì)胞凍存時(shí)要嚴(yán)格進(jìn)行梯度降溫(-4℃→-20℃~-40℃→-80℃→液氮)。要知道冰火兩重天的生活環(huán)境只會(huì)讓嬌弱的細(xì)胞自爆身亡,謹(jǐn)記:緩降溫!但如果真心趕時(shí)間時(shí),可以使用細(xì)胞凍存盒進(jìn)行細(xì)胞凍存,而后盡快將其轉(zhuǎn)入液氮中。此外,要定期測(cè)量液氮罐里的液氮儲(chǔ)備,以保證細(xì)胞全部浸在液面下。

 

8. 細(xì)胞解凍時(shí),由于凍存管管壁較厚、隔熱,而導(dǎo)致水浴時(shí)間太長(zhǎng)(2min還沒(méi)融化)時(shí),可以將水浴鍋的溫度調(diào)至40℃左右,可以縮短解凍時(shí)間。

 

9. 提前預(yù)定超凈臺(tái),減少?gòu)?fù)蘇后插在冰盒里等待的時(shí)間,可避免細(xì)胞房人滿為患,超凈臺(tái)使用緊張,復(fù)蘇1h后,還沒(méi)有加入新的培養(yǎng)液。(高濃度DMSO防止胞內(nèi)形成冰晶,凍存時(shí)保護(hù)細(xì)胞,但復(fù)蘇融解后,浸泡時(shí)間太久會(huì)對(duì)細(xì)胞有毒性)

 

10. 復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)一定要有耐心,因?yàn)橛行┘?xì)胞在復(fù)蘇一星期后才會(huì)真正有起色。因而,盡管細(xì)胞在復(fù)蘇三四天后沒(méi)有任何動(dòng)靜,也不要輕易倒掉所有細(xì)胞,要耐心等待,兩周后再做決定。

 

11. 有關(guān)DMSO的一些注意事項(xiàng):

 

?(1) DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中,降低冰點(diǎn)、延緩凍存過(guò)程,同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)的離子濃度、減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少細(xì)胞損傷程度。

 

?(2) DMSO在溶解過(guò)程中會(huì)放熱,應(yīng)先與培養(yǎng)基混勻后再加血清,同時(shí)凍存液提前配置,DMSO現(xiàn)配對(duì)細(xì)胞的毒性可能更大;

 

?(3) 復(fù)蘇時(shí),要離心去除DMSO,并用新鮮的培養(yǎng)基洗滌1-2次,注意離心的時(shí)候速度不要太快。

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