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細(xì)胞不貼壁、生長(zhǎng)緩慢、生長(zhǎng)不好、甚至死亡的可能原因及解決方法

更新時(shí)間:2016-07-01      點(diǎn)擊次數(shù):12823

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)這樣或那樣的問(wèn)題,從細(xì)胞生長(zhǎng)角度來(lái)說(shuō),針對(duì)細(xì)胞不貼壁、生長(zhǎng)緩慢、生長(zhǎng)不好,甚至死亡的原因.

 

一、培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁

可能原因: 

 

胰蛋白酶消化過(guò)度 

 

支原體污染 

培養(yǎng)基pH值過(guò)堿(NaHCO3分解)               

 

細(xì)胞老化 

 

接種細(xì)胞起始濃度太低或太高 

解決方法: 

 

縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度 

 

分離培養(yǎng)物,檢測(cè)支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物。 

 

使用無(wú)菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無(wú)菌CO2 

 

啟用新的保種細(xì)胞 

 

調(diào)節(jié)*接種細(xì)胞濃度

二、懸浮細(xì)胞成簇

可能原因: 

 

培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子; 

 

支原體污染; 

 

蛋白酶過(guò)度消化使得細(xì)胞裂解; 

 

DNA污染 

解決方法: 

 

用無(wú)鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞,輕巧吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液; 

 

分離培養(yǎng)物,檢測(cè)支原體; 

 

用DNaseI處理細(xì)胞

三、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢

可能原因:

由于更換不同培養(yǎng)液或血清; 

培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子耗盡或缺乏或已被破壞; 

培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染; 

試劑保存不當(dāng); 

接種細(xì)胞起始濃度太低; 

細(xì)胞已老化; 

支原體污染 

解決方法: 

比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分,比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn),讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液; 

換入新鮮配置培養(yǎng)液,或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長(zhǎng)因子;

用無(wú)抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)污染,丟棄培養(yǎng)物;

血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存,需在1周內(nèi)用完;

增加接種細(xì)胞起始濃度; 

換用新的保種細(xì)胞; 

分離培養(yǎng)物,檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物。

四、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)不好

可能原因:

細(xì)胞本身的狀態(tài)

 

細(xì)胞傳代次數(shù)多,細(xì)胞老化;

細(xì)胞的接種量:接種量過(guò)低,細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢;

細(xì)胞傳代時(shí)間過(guò)晚:細(xì)胞中毒,影響傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng);

胰酶消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短:時(shí)間過(guò)長(zhǎng),細(xì)胞死亡;時(shí)間過(guò)短,細(xì)胞未*分離而成團(tuán),細(xì)胞死亡;

細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇:慢凍速融。

 

污染

支原體污染

霉菌污染

培養(yǎng)基或血清

 

更換血清或培養(yǎng)基之前未進(jìn)行驗(yàn)證

選擇的培養(yǎng)基是否合適

培養(yǎng)基配制是否準(zhǔn)確無(wú)誤

培養(yǎng)環(huán)境

CO2供應(yīng)是否正常

培養(yǎng)箱或搖床溫度控制是否正確

…………

解決方法:

根據(jù)以上四個(gè)方面的可能原因,做出針對(duì)性的解決方案

注意細(xì)胞的本身狀態(tài):如傳代次數(shù)、接種量等;

避免產(chǎn)生污染(用正規(guī)、合法、可溯源的血清)

要用合適的血清或培養(yǎng)基,經(jīng)過(guò)驗(yàn)證

注意實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境

 

五、培養(yǎng)細(xì)胞死亡

可能原因: 

培養(yǎng)箱內(nèi)無(wú)CO2; 

培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大; 

細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過(guò)程中損傷; 

培養(yǎng)液滲透壓不正確; 

培養(yǎng)液中有毒代謝產(chǎn)物堆積 

解決方法: 

檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)CO2; 

檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度; 

取新的保存細(xì)胞種; 

檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓; 

換入新鮮培養(yǎng)液

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